氯霉素ELISA试剂盒酶联免疫法检氯霉素 1．简要信息此试剂盒可以定量检测氯霉素浓度。可做96个检测 2．应用领域此试剂盒是定量检测牛奶，蜂蜜，尿，血浆，蛋和肉等的氯霉素浓度，这个试剂盒适合于检测氯霉素以及它的葡萄糖苷酸酶（主要是尿的代谢物）。 3．使用方向此试剂盒是利用竞争酶联免疫方法检测b-agonists药物残留，适合于检测人体，牛和猪的尿样，血清，以及眼，肝，饲料，牛奶和奶粉。 不需要样品纯化，对于尿和血清样品不需要前处理直接使用，对于其他生物样品的前处理也是非常快速的。 4．检测原理此试剂盒是在包被有绵羊抗兔IgG的塑料微孔板上操作，氯霉素标准品，样品，酶耦合物以及兔抗氯霉素抗体加入到微孔中。在培养期间，游离的氯霉素和标记有酶的氯霉素竞争于抗氯霉素抗体结合，抗氯霉素抗体和固定在微孔壁上的绵羊抗兔IgG结合。任何没有结合的酶耦合物在冲洗阶段，酶的活性由加入的显色酶底物的量决定。酶使无色的染色剂转变成蓝色，加入终止液后是微孔从蓝色变成黄色，然后通过450nm酶标仪读数，颜色的密度和样品中氯霉素的浓度成反比。 5．提供的试剂微孔板（12?8）：包被有绵羊抗兔IgG 标准液：6瓶不同浓度的氯霉素标准溶液（1ml容量），分别是0ppb，0.1ppb, 0.2ppb, 0.5ppb, 1ppb, 2ppb，白色盖子的玻璃瓶。 抗氯霉素抗体：12ml的蓝色盖玻璃瓶 酶耦合物(enzyme conjugate)：250ul的绿色安培瓶 10倍浓缩的冲洗液(washing buffer)：50mL的塑料瓶 发展液（developing solution）：24mL的塑料安培瓶 终止液(stop solution)：1瓶白色盖子的9ml溶液 酶偶合物稀释液（enzyme conjugate diluent）:12ml的玻璃瓶，红色盖子 氯霉素标准添加液（CAP spiking solution）:1毫升100ng/ml的80%甲醇水溶液 稀释缓冲液（Dilution buffer）:50ml的塑料瓶 6．实验需要但是没有提供的材料样品准备过程： - 正己烷 - 回转振荡器 - 旋涡 - 水浴锅 - 均质机 - 离心机 - 天平 - 乙酸乙脂 - 醋酸 - 异辛烷/氯仿混合物（2：3，V/V） - HELIX POMATIA JUICE 检测过程： - 20-200ul的可调精确微量加样枪以及加样头 - 50-200ul的可调多道微量加样枪以及加样头 - 450nm的酶标仪 7．使用者需要的警告和注意点 - 只能做提外检测 - 试剂包含防腐剂，终止液包含硫酸具有腐 蚀性。酶偶合物也是有害的，标准溶液有小量的氯霉素是至癌的。由于浓度很低，所以标准品和CAP SPIKING SOLUTION是没有危险的。但是氯霉素标准添加液（CAP SPIKING SOLUTION）因为有甲醇存在，所以是有毒的并且是易燃的。 - 取试剂时要小心，避免接触到皮肤，眼睛和黏膜。 - 对于专职使用者可以使用索取安全数据表 - 不要使用过期的试剂 - 不要混合不同试剂盒内的溶液 8．处理和存储介绍 - 在2-8℃储存，不能冷冻 - 把未使用的微孔条放回原来有干燥剂的铝薄袋，并且密封好。 9．样品准备 9．1血清和血浆样品 加1mL的样品到2ml的乙酸乙脂中混合1分钟，离心后，取1ml上层溶液（乙酸乙脂）到玻璃试管中，在50℃的氮蒸汽中蒸发。把蒸发后残留物质溶解在500ul的稀释缓冲溶液中（1?），样品添加量为50ul，所以稀释因子是1。 9．2尿和水 - 方法1（水和尿）：把PH值调到7?0.5后，样品可以直接加到检测孔中，或者可以先用稀释缓冲液（1?）稀释5倍或者10倍 - 方法2（尿）：滴加几滴1摩尔的醋酸把尿样的PH值调整到4.8，加25ul的HELIX POMATIA JUICE混合，然后在55℃培养2小时或者37℃过夜培养，把PH值调到7?0.5后加2ml的乙酸乙脂。在旋涡中混合1分钟，把两相分开，取1ml的上层液（乙酸乙脂）放在玻璃管内，然后在50℃的氮蒸汽中蒸发，把残留物溶解在500ul的稀释缓冲液中，稀释因子是1。 9．3肉，饲料和蛋 - 把4克均质样放在小管中 - 加6ml的乙酸乙脂，然后在旋转混合器（400转）中混合30分钟 - 离心10分钟后（2000转），取出3ml的乙酸乙脂相到试管，然后50℃的氮蒸汽中蒸发。脂肪残留物溶解在1.5ml的异辛烷/氯仿混合物（2：3，V：V），再加1ml的稀释缓冲液（1?），使用旋转混合器混合30分钟然后离心10分钟（2000转），为了取消上层溶液的泡沫等乳状液，把试管在80℃的水浴中静止5分钟，然后离心10分钟（2000转）。取50ul的上层液进行实验，稀释因子0.5倍。 - 也可以选择把脂肪残留物溶解在1.5ml的正已烷，再加1ml的稀释缓冲液，使用回转振荡器混合30分钟，然后离心10分钟（2000转），为了取消上层溶液的泡沫等乳状液，把试管在80℃的水浴中静止5分钟，然后离心10分钟（2000转）。取下层溶液为待检样，如果是带脂肪的猪肉，需要用正己烷再次提取5分钟，取下层溶液为50ul作为检测样，稀释因子是0.5倍。 9．4蜂蜜 - 取3克的蜂蜜到测试管，加1ml水，把蜂蜜样品放在60℃水浴中几分钟。加6ml乙酸乙脂，在回转振荡器中混合30分钟。离心10分钟（2000转），把6ml的乙酸乙脂转移到试管中，然后在50℃的氮蒸汽中蒸发。残留物溶解在1.5ml的异辛烷/氯仿混合物（2：3，V：V）和0.75ml的稀释缓冲液（1?）中，然后回转振荡器混合30分钟，再离心10分钟（2000转）。 - 注意：为了去除上层液的乳化泡沫物质，应该把离心后的样品在80℃的水浴中培养5分钟，再次离心10分钟（2000转）。 - 取50ul的上层溶液（4克/ml的蜂蜜）作为检测样。稀释因子是0.25倍。 9．5牛奶 - 牛奶样品在4℃下离心10分钟脱脂（2000转），加5ml的乙酸乙脂到2.5ml的脱脂奶中混合。然后旋涡混合1分钟，通过离心5分（2000转）使两相分开，取4ml的上层相（乙酸乙脂）到试管中，然后50℃的氮蒸汽中蒸发，残留物溶解在200ul的稀释缓冲液中（1?），稀释因子是0.1倍。 9．6 虾和鱼 - 称取50克的虾打碎均质，取10克均质后样品到测试管，加20ml的乙酸乙脂，然后回旋振荡器混合10分钟。混合后离心10分钟（10分钟）或者滤纸过滤，10ml的乙酸乙脂离心后转移到玻璃管，然后50℃的氮蒸汽中蒸发。 - 残留物溶解在2ml的n-己烷，并且加1ml的稀释缓冲液（1?），充分混合30分钟。为了消除溶液表面的乳状泡沫，把试管放在80℃水浴锅中培养5分钟，然后在2000转离心10分钟。 - 用巴斯德吸量管，把下层转移到清洁的玻璃管，加1ml的正己烷，充分混合5分钟，离心5分钟（2000转）。 - 取50ul下层液体做样品做检测，稀释因子是0.2倍。 10．工作溶液准备氯霉素标准溶液：即时使用 酶偶合物稀释液：即时使用 酶耦合物：根据需要检测的样品量计算出总共需要的量，用酶偶合物稀释液稀释200倍浓缩的酶偶合物。 抗氯霉素抗体：即时使用 冲洗缓冲液：对浓缩也1：10稀释（1 9），注意：当有结晶体存在时，在室温搅拌直至完全溶解 稀释缓冲液：用蒸馏水稀释缓冲液1：5（1 4） 发展液：即时使用，染色剂和发展液对光敏感，避免直接光照。 终止液：即时使用，注意：里面含有2M的硫酸，所以在操作时要小心，万一接触到皮肤和眼立即用水冲洗 11．酶联免疫操作过程 11．1操作前的需要注意 1．把所有试剂都恢复到室温后再使用 2．完成实验后把试剂马上放回2-8℃的环境 3．不要改变操作程序，特别是下面的情况： - 不要延长第一次培养时间 - 不要在超过25℃的室温培养 - 培养期间不要振荡微孔板 - 使用精确和正确的加样枪 4．一旦开始实验，不要中断实验 5．ELISA的重现性依靠冲洗过程的效率和一致性，所以要严格按照说明书中的冲洗过程来操作。 6．每次加样都要使用新的加样头，以免发生交叉污染 7．加样时不要使加样头接触微孔板中的液体或者微孔壁 8．培养时避免直接光照射，建议使用一块板盖住微孔板 11．2实验过程 1．预先准备好需要做的小孔数包括标准品，样品以及空白孔，最大结合率孔。 2．- 加150ul的稀释缓冲液到空白孔 - 加50ul的各个标准浓度标准品和样品到指定小孔 4．使用多道加样枪吸取50ul的酶耦合物到每个小孔。 5．加100uL氯霉素抗体到每个小孔（除了空白孔之外），轻轻摇微孔板几秒钟。 6．在室温培养30分钟（20-25℃） 不要在第一个培养时间段延长时间 5．冲洗次序 - 倒掉小孔中的液体 - 用装有工作冲洗液的洗瓶充满整 个小孔，然后倒掉冲洗液- -重复刚才的冲洗程序5次 - 在吸水纸上倒扣微孔板并且重重的拍打微孔板，吸去多余的水滴 但是不能使小孔干掉 6．使用多道加样枪吸取200ul的发展液到每个小孔并且柔和的振荡几秒钟。 7．在室温培养15分钟（20-25℃） 8．使用多道加样枪吸取50ul的终止液到每个小孔，并且彻底的振荡几秒钟。 9．在450nm的光栅下用酶标仪读数，60分钟内必须读数。 12．结果计算 计算最大结合率的吸光度值（即0ppb），以及样品和标准品的吸光度值。把每个样品和标准品的吸光度值，最大结合率值（B0）减去空白的吸光度值。计算出减去空白值的样品和标准品吸光度值除以最大结合率吸光度值（0ppb）的比值，在乘以100变成百分比。因此最大结合率的值应该是100%，吸光度比值用百分比表示。 13．试剂盒参数描述 参数 平均空白吸光度 ≤0.15 OD450nm 平均Bo吸光度 ≥0.7 OD450nm B/Bo 50% 0.4-0.9ng/ml C.V.(%) 肌肉，蜂蜜和牛奶的回收率 ≤6 85-100% 氯霉素检测限 0.1ng/ml 14．整个实验需要的时间样品准备时间 试剂操作过程 血清/血浆 15分钟 45分钟 尿 3小时或者过夜 肉，饲料，蜂蜜，蛋，鱼，虾 2小时 牛奶 45分钟 15．特异性 I‘screen CAP试剂盒的特异性根据下面的交叉反应来决定的。 相关物质 交叉反应率 Chloramphenicol(CAP) 100% CAP glucuronide 70% 16．可选择的补充提取法 1．鱼和虾（低量的第二选择法） - 取4克均质后样品到测试管 - 加6ml的乙酸乙脂，然后用回旋振荡器混合30分钟。 - 离心10分钟（2000转），转移其中3ml的乙酸乙脂到新的测试管，使用氮蒸汽或者空气蒸汽在60℃下蒸发干。 - 此脂肪残留物溶解在1ml的异辛烷和氯仿混合物（2：3；V/V） - 加0.5ml的稀释缓冲溶液（1?），旋涡一分钟，然后离心10分钟（2000转）。 - 为了消除溶液表面的乳状泡沫，把试管放在80℃水浴锅中培养5分钟，然后在2000 转离心10分钟。取50ul的上层液作为待检样，稀释因子是0.25倍。 2．蜂蜜（简单程序） - 称取2克蜂蜜样品到测试管，加4ml的蒸馏水，然后在60℃水浴中放置几分钟。 - 加4ml的乙酸乙脂，然后用旋转混合器混合30分钟。离心10分钟（2000转），把2ml离心后的乙酸乙脂转移到测试管，使用氮蒸汽或者空气蒸汽在60℃下蒸发干。残留物溶解在0.5ml的稀释缓冲溶液中。 - 取50ul（4克蜂蜜/ml）的提取液作为检测样品，稀释因子是0.5倍