|
联系我们
|
| 地 址：江苏南京市光华路1号南理工科技园孵化大楼一楼C042室 |
| 邮 编：210014 |
| 联系人：尹先生 |
| 电 话：025-83312752 025-84372482 |
| 传 真：025-83738955 |
| 邮 箱：1017299774@qq.com |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
提 供 商：
南京科捷分析仪器有限公司
|
|
资料大小：
132K
|
|
发布时间：
2007-11-08
|
|
浏览次数：
845
|
|
|
| |
| |
资料介绍
高效液相色谱柱
怎样选择色谱柱
现代高效液相色谱中，分离效果好坏很大程度上取决于色谱填料的选择。但
是色谱填料的选择范围很宽，要做合适的选择，必须对此有一定的认识和了解。
1、正相色谱
正相色谱用的固定相通常为硅胶（Silica），以及其他具有极性官能团，如胺基团
(NH2,APS)和氰基团（CN，CPS）的键合相填料。
由于硅胶表面的硅羟基（SiOH）或其他团的极性较强，因此，分离的次序是依据样品
中的各组份的极性大小，即极性强弱的组份最先被冲洗出色谱柱。
正相色谱使用的流动相极性相对比固定相低，如：正乙烷（Hexane）,氯仿
（Chloroform）,二氯甲烷（Methylene Chloride）等。
2、反相色谱
反相色谱填料常是以硅胶为基础，表面键合有极性相对较弱的官能团的键合相。
反相色谱所使用的流动相极性较强，通常为水，缓冲液与甲醇，已腈等混合物。
样品流出色谱柱的顺序是极性较强组合最先被冲出，而极性弱的组份会在色谱柱上有
更强的保留。
常用的反相填料有C18（ODS）、C8（MOS）、C4（B）、C6H5（Phenyl）等。
二、聚合物填料
聚合物调料多为聚苯乙烯-二乙烯基苯或聚甲基丙酸酯等，其主要优点是在PH值为1～
14均可使用。
相对与硅胶基质的C18填料，这类填料具有更强的疏水性；大孔的聚合物填料对蛋白
质等样品的分离非常有效。
现在的聚合物填料的缺点是相对硅胶基质填料，色谱柱柱效较低。
三、其他无机填料
其它HPLC的无机填料色谱柱也已经商品化。由于其特殊的性质，一般仅限于特殊的
用途。如石墨化碳也用于正逐渐成为反相色谱填料。这种填料的分离不同与硅胶基质烷基
键合相，石墨化碳的表面即是保留的基础，不再需其它的表面改性，该柱填料一般比烷基
键合硅胶或多孔聚合物填料的保留能力更强，石墨化碳可用于分离某些几何导构体，又由
于HPLC流动相中不会被溶解，这类柱可在任何PH与温度下使用。氧化铝也可用于HPLC，
氧化铝微粒刚性强，可制成稳定的色谱柱柱床，其优点是可在PH高达12的流动相中使用。
但由于氧化铝与碱性化合物作用也很强，应用范围受到一定的限制，所以未能广泛应用，
新型氧化锆填料也可用于HPLC，商品化的仅有聚合物涂层的多孔氧化锆微球色谱柱，应
用PH范围1～14，温度可达100℃。由于氧化锆填料几年才开始研究，加之面临的实验难
度，其重要用途与优势尚在进行中。
怎样选择填料粒度
目前，商品化的色谱料粒度从1um到超过30um均有销售，而目前分析分离主要用3um、
5um和10um填料，填料的粒度主要影响填充柱的两个参数，即柱效和背压。粒度越小，填
充柱的柱效越高；小于3um的填料应用，在相同选择性条件下，提高柱效可提高分离度，
但不是唯一的因素。如果固定相选择是正确，但是分离度不够，那么选择更小粒度的填料
是很有用的，3um填料填充柱的柱数比相同条件下的5um填料的柱效提高近30%；然而，
3um的色相谱的背压却是5um的2倍。与此同时，柱效提高意味着在相同条件下可以选择更
短的色谱柱，以缩短分析时间，另外，可以采用低粘度的溶剂做流动相或增加色谱柱的使
用温度，比如用乙腈代替甲醇，以降低色谱柱的压力。
一、如何保证良好的柱性能与柱寿命
◆ 认证阅读色谱柱使用说明书；
◆ 使用填充良好的色谱柱；
◆ 尽量减少压力波动，避免机械及热冲击；
◆ 使用保护柱及在线过滤器；
◆ 经常以强溶剂冲洗色谱柱；
◆ 充分过滤样品及流动相，尽量避免杂质微粒与强保留成分；
◆ 用稳定的固定相（C18最稳定）；
◆ 在中等PH值操作（6~8），用有机缓冲溶液；
◆ 色谱柱使用温度最好小于40℃；
◆ 硅胶基质的的色谱柱，应保持流动相的PH值范围在3.0~8.0；
◆ 在水流动相与缓冲溶液中加200ppm的叠氮钠；
◆ 流动相中含有缓冲溶液，应注意应95∶5的水及有机溶剂过渡，有机溶剂不能低于5%；
◆ 过夜或贮存时，冲洗掉盐和缓冲液，用纯有机溶剂流动相保存（乙晴最好）。
HPLC固定相及应用范围
名称 别名 功能基团 正相 反相 离子对 应用
Silica -OH √ 非极性和中等极性以及非离子性有机化合物。
SAS C1 -(CH3)3 √ 在所有的烷基键合相中对非极性化合物保留最
弱，典型用于中等极性和多官能团化合物.
Butyl C4 -C4H9 √ √ 分离肽和蛋白质，保留时间比C8和C18短。
MOS C8， -C8H17 √ √ 中等极性相中对中等化合物，小肽和蛋白质，
Octyl 极性药族化合物和环境样品。
ODS C18 -C18H37 √ √ 烷基键合相中对中等极性化合物保留最强。广
泛用于药物，甾族化合物，脂肪酸和环境样品.
CPS CN ,Cyano -(CH2)3CN √ √ 对极性化合物有独特的选择性，适合应用于正相
(propyl 分离，当用于反相系统时，其选择性与 C8和
Nitrile) C18不同，在药学领域和复杂混合物的分离中应
用广泛。
APS NH2 -(CH2)3 NH2 √ √ 反相中分析糖类和其他极性化合物。弱阴离子交
(Amino Propyl) 换 ，阴离子和有机酸则应用缓冲剂和有机改性
剂 做流动相。正相中与硅胶的选择性机改性剂
不同,分析芳香族效果很好。
Phenyl -(CH3)C6H5 √ √ 芳香族化合物
Diol -(CH2)2O √ √ 反相时，分离肽和蛋白质。正相时，与硅选择
CH2(CH2OH)2 性 相似,但极性较弱。
SCX 强阳离子 -(CH2)2C6H4SO3H- √ 有机碱
交换
SAX 强阴离子 -(CH2)3N+(CH3)3 有机酸，核苷和核苷酸
交换
二、如何解决色谱柱使用过程中出现的问题
1.保留值与分离度重现性不好原因分析
问题 原因 表现
不同色谱柱间差异 填料、键合相不同 保留因子（k），分离因子（α）
使用期间柱变化 柱床破坏 柱效（N）
键合相丢失 保留因子（k），分离子（α）
硅胶基质溶解 柱效（N）
强保留分堆积堵塞 保留因子（k），柱效（N）
柱外效应 系统差异，进样量大、 柱效（N）
进样阀与 色谱柱之间、
色谱柱与检测器之间管
路太长、检测器流通池
体积大、接头死体积大
等。
分离效果变差 流动相组分改变 保留因子（k），柱效变化很小
流速改变 保留因子（k），分离因子（α）
温度改变 保留因子（k），柱效变化很小
柱平衡慢 重新平衡时间不够 保留因子（k），柱效变化很小
柱超载 样品量太大 保留因子（k），柱效（N）
2.造成色谱峰（不对称）拖尾的原因
1.色谱柱本身填装问题，筛板堵塞或填料塌陷；
2.柱头有污染；
3样品超载；
4样品溶剂不合适；
5.柱外效应；
6化学或二次保留（硅羟基）效应；
7缓冲容量不足或不合适；
8重金属污染。
3.如何解决峰形拖尾的问题
A．与化学有关的拖尾问题
1．流动相中，加入30mM的三乙胺（用与碱性化合物）或醋酸胺（用与酸性化合物），未
知化合物加醋酸三乙胺；
2．如仍然拖尾，将三乙胺换为二甲基辛胺（或醋酸二甲基辛胺）；
3．降低进样量至<1ug。
B．与色谱柱有关的拖尾问题
1．如柱头处有强保留的样品组分积聚，反相柱可用20倍柱体积的96%的二碌甲烷与4%甲
醇，加1%氢氧化铵混合液冲洗，正向柱可用甲醇冲洗。
2．使用保护柱
C．与HPLC 系统有关的峰拖尾和峰加宽
1．进样体积过大，（通常≤25uL）；
2．进样阀与色谱柱及检测器之间的管路体积过大（最佳连接管应<20cm，内径为0.007″）；
3．检测器流通池的体积过大。
4．如何储存色谱柱
1．防止缓冲溶液和水溶液流动相产生微生物，做到流动相用多少配多少，或在水流动相中加200ppm的叠氮钠以抑制细菌成长（一定当心其毒性和潜在的爆炸性）；或在流动相中加20%的有机改性剂，也可抑制微生物生长，有机改性剂还有助于流动相脱气。
2．尽可能将色谱柱贮存于100%有机溶剂（乙晴最好）中，避免在缓冲溶液中保存。
3．使用缓冲溶液后的色谱柱，应用15～20倍柱体积的不含缓冲剂的同种水—有机溶剂流动相冲洗色谱柱，后
|
|
|
|
