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提 供 商：
上海同田生物技术有限公司-高速逆流色谱仪HSCCC
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资料大小：
132K
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发布时间：
2007-01-19
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浏览次数：
1418
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资料介绍
本文介绍了高速逆流色谱技术的工作原理、特点以及近几年在中药分析尤其是植物药有效成分分离纯化方面的应用情况，并对高速逆流色诺技术在中药分析中的应用前景进行了展望。
高速逆流色谱技术在天然产物分离及中药质控中的应用
第二军医大学药学院(上海200433)
黄宝康 秦路平 郑汉臣 宓鹤鸣
摘要 本文介绍了高速逆流色谱技术的工作原理、特点以及近几年在中药分析尤其是植物药有效成分分离纯化方面的应用情况，并对高速逆流色诺技术在中药分析中的应用前景进行了展望。
关键词 高速逆流色谱 天然产物 中药质控
高速逆流色谱(High-speed Countercurrent Chromatography, 简称HSCCC) 技术是一种较新型的液—液分配技术，它不用任何固体载体或文撑体，于1982年由Yiochiro Ito博士首创[1]。其原理是基于组分在旋转螺族管内的相对移动而互不混溶的两相溶剂间分布不同而获得分离。从原理上讲与液液分配色诺完全相同，但所用的技术不同.采用一根100多米长的空心柱，实现无载体快速高效分离.可用于分析各类化合物。到目前为止，此项技术已用于生物化学、生物工程、医学、药学、天然产物化学、有机合成、化工、环境、农业、食品、材料等领域。美国、日本、中国、俄罗斯、法国、英国、瑞士等国都开展了此项研究。美国FDA及世界卫生组织（WHO)都引用此项技术作为抗生素成分的分离捡定，80年代后期各国学者迅速认识到该项技术的应用和开发价值，并被广泛地应用于天然药物成分的分离制备和中药的分析签定中。
1 HSCCC工作原理及特点
1.1 HSCCC的工作原理 HSCCC同逆流色谱技术一样，也是基于液液分配原理。当仪器工作时，互不相溶的两相溶剂在绕成线圈的聚四氟乙烯管内具有单向性流体动力平衡性质，溶剂在聚四氟乙烯管内作高速行星运转时，如用其中一相溶剂作固定相爱，则恒流泵可以输送另一相溶剂载着样品穿过固定相。两相溶剂在螺旋管中实现高效的接触、混合、分配和传递。由于样品中各组分在两相中的分配能力不同，导致在聚四氟乙烯管中移动的速度也不同，因而能使样品中各组分得到分离。Ito将所用的溶剂系统分为三类:亲水性系统，由极性小的非水相与水相组成，两相极性相差很大；亲油性系统，由高极性的非水相与水相组成，两相极性相差不大；还有一类处于两者之间，为中间系统。对于不同的组分可以采用不同的溶剂系统，控制不同的条件加以分离分析。
1.2 HSCCC的优点 HSCCC主要具有以下几个方面的优点。
1.2.1 应用范围广，适应性好。由于溶剂系统的组成与配比可以是无限多的，因而从理论上讲HSCCC可以适用于任何极性范围的样品的分离，所以在分离天然化合物方面具有其独到之处。而且聚四氟乙烯管中的固定相不需要载体，因而消除了气液色谱中由于使用载体而带来的吸附现象，特别适用于分离极性物质和其它具有生物活性的物质。
1.2.2 操作简便，容易掌握。仪器操作简单，对样品的预处理要求低，仅需一般的粗提物即可进行HSCCC的制备分离或分析。
1.2.3 回收率高。由于该色谱技术没有固定载体，不存在吸附和降解，理论上样品的回收率可达100％。在实验中只要调整好分离条件，一般都有很高的回收率。
1.2.4 重现性好。如果样品不具有较强的表面活性作用，酸碱性也本强，那么多次进样，其分离过程都保持很稳定、峰的保留相对标准偏差小于2%，而且重现性相当好。
1.2.5 分离效率高，分离量较大。由于其与一般色谱的分离方式不同，能实现梯度操作利反相操作、亦能进行重复进样，使其特别适用于制备性分离，产品纯度高，不存在载体对样品的吸附和粘染。制备量大，溶剂消耗少。最近的研究结果表明:一台普通的高速逆流色谱仪一次进样可达几十毫升，一次可分离近10g的样品。因此，在80年代后期被广泛地应用于植物化学成分的分离制备研究。
根据以上特点，HSCCC技术的优点非常适合于中药成分的分离和分析。目前高速逆流色谱仪已成功地开发出分析型和制备型两大系列，制备或半制备HSCCC的特点是高流速、高浓度，不但适用于非极性化合物的分离，也适用于极性化合物的分离，对检测器的灵敏度要求不高，常配以各种波长的紫外吸收（UV）检测器。在制备分离方面，可用于中药粗提物中各组分的分离，也可进一步精制，甚至直接从粗提物进一步纯化到纯品，来制备中药化学成分标准品。HSCCC还可用于定量分析，进样量可大可小。分析型HSCCC的分离度、重现性与HPLC相似，但仪器价格低廉，性能可靠，分析成本低，易于操作，是一种适用于中药质控的现代化仪器。与分析型HSCCC连接的检测器有:紫外检测器（LV或RAD）、傅立叶变换红外检测器（FTIR）、质谱（MS）、蒸发激光散射检测器（ELSAD）等。
2 HSCCC技术在天然药物活性成分分离中的应用
在中药的分离分析中，HSCCC已用于各类化学成分如生物碱、黄酮类、萜类、木脂素、香豆素类成分的分离纯化、近几年来研究较多的主要有以下一些天然药物。
2.1 银杏 Gingkgo biloba 为银杏科植物，种子和叶均可入药。叶含白果内酯、银杏新内酯等丙酮类化合物。其中银杏萜类内酯具有特殊的药理作用，为银杏叶中特有的生物活性成分。采用氯仿甲醇-水（4:3:2）的溶剂充分混合后，临用前将其分开，在室温下，下相作流动相，上相作固定相，以2.0ml/min的流速，由首端向尾端洗脱，转速800r/min， 固定相保留值为78%，叶提取物进样是为2.0ml，经一次HSCCC即可分离制得白果内酯单体，并经MS、IR得到确认[2]。此外还利用HSCCC与HPLC相结合，以水为固定相，开始以乙酸乙酯为流动相，然后在流动相中逐渐添加异丁醇，到分离结束时乙酸乙酯与异丁醇之比为（6:4），从500mg的叶提取物中一次分离出了异鼠李素等7个黄酮苷，经HPLC分析纯度达98%以上。
2.2 丹参 Salvia miltiorrhiza 为唇形鼠尾草属植物，以根入药，主要有含结晶性呋喃并菲醌类色素。具有祛瘀生新，活血调经，清心除烦的功效。采用HSCCC分极梯度洗脱，使用三种溶剂系统，控制实验条件，石油醚提取物进样量50mg，一次过柱就可分离纯化得到丹参酮IIA(tonshinone II A )7mg ，丹参酮I（tanshinoneI）3mg，隐丹参酮(cryptotanshinone) 4 mg[3]。
2.3 粉防己 Stephania tetrandra 为防己科千金藤属植物，主要含生物碱类。用正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水（3:7:5:5）为溶剂系统，以1800r/min的转速，70min内从粉防己干燥根提取物中分离了粉防己碱（tetrandrine）、去甲粉防己碱（fangchinoline）和轮环藤酚碱（cyclanoline）。
2.4 黄连 Cotis chinensis 为毛莨科植物，主要含小檗碱等生物碱。利用制备型HSCCC从黄连根生物碱粗提物中分离纯化得到巴马亭（palmatine）、小檗碱（epiberberine）及黄连碱（coptisine）[4]。
2.5 虎杖 Polygonum cuspidatwn 为蓼科蓼属植物，以根、根状茎、茎、叶入药，含蒽醌类化合物等成分。分别用氯仿-甲醇-水（4:3:2）、乙酸乙酯提取物及水提物中分得白藜芦醇（resveratrol）、云杉新苷（piceid）得率分别为2.18%、1.07%（以干药材计），化合物经MS与1HNMR鉴定[5]。
2.6 葛 Pueraria lobata 为豆科葛属植物，含黄酮类化合物。用乙酸乙酯-正丁醇-水（2:1:3）为溶剂系统，从80mg根粗提物中经HSCCC进一步分离得到包括葛根素（puerarin）在内的七个异黄酮类化合物[6]。
2.7 苹果 Malus pumila 为蔷薇科植物。果实为常见水果，主含碳水化合物及有机酸。苹果皮含有色素类成分。Shibusawa等采用HSCCC技术以乙酸乙酯:水（1:1）为溶剂系统（上层为流动相），流速1.0ml/min，一次进样操作便得到了聚合程度不同的原矢车菊素(procyanidin)并对不同极性的溶剂系统，从非极性的正己烷系统到极性的溶剂系统，从非极性的正己烷系统到极性的正丁醇系统进行了比较，分离Procyanidin A及procyanidin B。效果最佳的为正丁醇-乙酸乙酯-乙腈-0.1%三氟乙酸（2:4:3:8）溶剂系统，以下层作流动相，相流速为1.0ml/min[7]。
2.8 牛膝 Achyranthes bidentata 为苋科牛膝属植物，多糖类为其活性成分之一。以12.5%聚乙二醇（PEG）1000与此同时65%磷酸钾缓冲液组成的水性二相系统，上层作为流动相，下层作为固定相，在交叉同步线圈行星离心式高速逆流色谱仪上，成功地分离出了多糖部分和蛋白多糖部分，实现了牛膝多糖的分离和纯化[8]。
2.9 宽叶羌活 Notopterygium forbessi 为伞形科背翅芹属植物，又称大头羌，以根状茎和根入药。具有解表，祛风湿，止痛的功效。以石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(比例从5:5:4.8:5至5:5:5:4)为溶刘系统，采用HSCCC从中分离得到notopterol、isoimperatorin，纯度在98％以上[9]。
2.10 红豆杉 Taxus chinensis 为红豆杉科植物，含抗肿瘤活性成分紫杉醇。其粗提物采用正己烷-乙酸乙酯-乙醇水（2:5:2:5）及正己烷-氯仿-甲醇-水（5:25:34:20）为溶剂系统，分离纯化得到10-脱乙酰浆果紫杉素（10-deacelylbaccatin），纯度在意%以上[10]。此外，分别用正己烷-乙酸乙酯-乙醇-水（6:3:2:5）和正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水（1:1:1:1）为溶剂系统，以上相作为固定相，下相为流动相，从红豆杉及云南红豆杉Taxux yunnanensis的粗提物中分离纯化了三个结构相似的紫杉烷类二萜化合物质紫杉醇（taxel）、Cephalomannine、浆果紫杉素（baccatin）。以石油醚（bp. 40~65ºC）-乙酸乙酯-甲醇-水（50:70:80:65）为两相体系，从紫杉醇的混合物中分离得到了了纯的紫杉醇和Ciphalomannine。
2.11 大黄 Rheum officinale 为蓼科大黄属植物，根状茎及根中含蒽醌类化合物约3%，以氯仿-甲醇-水（6:3:2）为溶剂系统，采用HSCCC以1800r/min的转速在15min内从大黄素（aloe-emodin）、大黄酸（rhein）、大黄酚(chrysophanol)、和大黄素(cmodin)；用正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水（9:1:5:5）梯度洗脱，在1800r/min转速下，70min内从掌叶大黄Rheun palmatum的根茎中也分离了大黄素甲醚、芦荟大黄酸、大黄酸、大黄酚和大黄素，纯度在98%以上[11]。
2.12 盐生肉苁蓉 Cistanche salsa 为列当科植物，具有补肾益精的功效。含有微量生物碱及葡萄糖甙类。以乙酸乙酯-正丁醇-乙醇-水（4:0.6:0.6:5，v/v）为溶剂系统，采用HSCCC技术从盐生肉苁蓉提取物中分离得到phenylethanoid glycosides(PhGs)、acteoside、2`-acetylacteoside，它们的化学结构经1HNMR，13
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