| 在菌落计数中，常常会碰到这样一种情况，即培养皿中生长着多种不同种类的菌落：有真菌、细菌、霉菌、放线菌等等。不同种类的菌落，往往颜色不同、生长形态不同。尤其是霉菌和放线菌，其表面往往呈碎颗粒状，碎颗粒的密度不一样，中间密度高从而颜色深、边上密度低从而颜色浅；另外其边缘往往呈毛刺状或云雾状，面积则比一般菌落大许多。图1显示了三个包含霉菌和其它菌混杂的培养皿。
图1 多菌种混杂生长的培养皿 这种多菌种混杂、尤其是存在霉菌和放线菌的情况，给自动化菌落计数带来困难。这是由于目前的自动化菌落计数是建立在图像分割技术基础上，而图像分割主要依据目标物与背景之间的差异性来进行的，比如两者的灰度差异、颜色差异、或边缘轮廓的突变性等等。
图2显示了采用传统图像分割技术，对包含霉菌的多菌种混杂的培养皿的分割效果。其中，图2-a是培养皿原图、图2-b是采用传统图像分割技术的分割结果、图2-c是对分割后的颗粒进行颜色填充以方便观察。不难看到：（1）由于霉菌表面呈碎颗粒状，导致图像分割将其分成一颗颗碎小颗粒。（2）霉菌表面的颜色变化，其边缘呈乳白色云雾状，转换成灰度后与其它白色菌落接近；而中间成墨绿色，转换成灰度后与背景的灰度相接近。这就导致传统的灰度分割技术必然把边缘部分当作菌落一类、而把中心部分当作背景一类来处理。（3）霉菌边缘的云雾状或模糊性，导致没有明显的边缘梯度变化，从而无法采用边缘梯度分割技术。
图2 传统图像分割技术对多菌种混杂情况的处理结果 基于水平集活动轮廓模型的图像分割技术，是目前国际上较为前沿的图像处理技术。该技术将水平集和活动轮廓模型结合起来，在极小化能量泛函的过程中，使活动轮廓不断逼近目标而实现对目标的分割。这一特点尤其适合对霉菌的检测，事实上，杭州迅数科技公司历经多年研究，已成功应用水平集活动轮廓模型解决霉菌放线菌等的检测，并取得理想效果（详见本公司网站文献《菌落计数_创新技术（1~3）》）。
但当霉菌放线菌与其它菌种混合在一起时，问题就变得更加复杂。这时，采用水平集活动轮廓模型往往对一种菌落有效、而对另一种菌落效果不好。在调整模型参数或约束条件后，对另一种菌落有效了、而对这种菌落的效果又不好了。事实上，上述培养皿所表现出来的，是一个多菌种、多目标、多特征的复杂问题。采用单一的水平集活动轮廓模型，已经无法取得理想效果。针对多目标、多特征的分割问题，目前国际上研究较多的主要有以下两种方法：（1）多相CV模型、（2）多层水平集框架模型。
1、多相CV模型
由Chan和Vese提出的一种多相水平集分割算法，即多相CV模型[1]。该算法在确定目标种类数之后，采用m个水平集函数相互约束地分割，并且可以用m个水平集函数表示2m个不重叠区域，从而避免在区域内部存在真空或者区域之间存在重叠现象。
多相CV模型的能量泛函为：
其中u0是原图像数据，cI是第I个区域的平均灰度值，xI是第I个区域的水平集表示，Фi为第i个水平集函数。以分割四相图像为例，引入两个水平集函数Ф1和Ф2，与此对应须设置两个初始轮廓，设图像u0被分为四个相互不重叠区域：
则能量泛函演变为：
其中Ф=(φ1,φ2)，c=(c11,c10,c01,c00)中的分量分别代表图像u0在Ω11，Ω12，Ω21和Ω22区域内的平均灰度，如图3所示。
图3两相水平集示意图 该模型中的两个轮廓短线同时演化，对应水平集函数也分别进行迭代运算，通过求解上式能量泛函对应的Euler-Lagrange方程可以得到梯度下降流公式如下：
其中灰度均值c11，c10，c01和c00可分别在每次迭代中采用如下方式进行更新：
2、多层水平集框架[2]
与多相CV模型采用多个水平集函数不同，多层水平集框架是建立在一种图层的概念上的，并且只用一个基于CV模型的水平集函数，以一种层级演化的方式来进行多目标分割，属于串行多相分割算法。
定义原始图层为
其中，  代表第 l类目标的第 i个区域。 lm表示第 l类目标的区域数目，并集  表示第 l类目标的集合，  为背景区。
首先利用单水平集分割出原始图层 L0，提取第一类目标区域，然后用除第一类目标区以外的区域灰度平均值掩盖该第一类目标区，产生一个新的背景区域类  ，图层状态变为： 
原始图层 L0到新图层 L1的转换过程如图4所示。原始图层 L0包含两类目标  和  ，当第一类目标区域  被分割出并用第二类目标区域与背景区域的灰度平均值替换时，形成图层 L1，这样 L1中只剩下第二类目标区域，剩下区域视为背景。当待分割图像有多类目标区域时，可以利用这一思想逐个分出某一类目标区域，直到没有目标为止，数学归纳如下：
图4 原始图像层L 0向新图像层L 1的转换 最终得到不含任何目标的图层Ln，即背景层Lbackground：
多层水平集框架仍依赖于CV模型，与传统CV模型不同的是，水平集函数一次只作用于一个图层，并对产生的新图层进行迭代演化，所以引入水平集函数，第l层(l=0,1,2,…,n-1)上的能量函数为：
与CV模型中参数相同，Cl表示Ll层上的演化曲线。引入时间变量t≥0，可得Ll上的水平集演化方程：
3、试验
以上介绍的多相CV模型，是一种并行模型。其可在不加约束条件的情况下，避免水平集函数作用区域的重叠覆盖以及漏覆盖问题。但多个水平集最终可能收敛到一个区域，另外该模型假定了图像中区域的个数。而实际菌落图像往往很复杂，难以人为划定区域，因此这种方法实际使用时会比较麻烦。多层水平集框架，属于水平集串行分割方法。其每次分割得到的轮廓曲线位于前一次分割得到的轮廓曲线内部，可以保证各水平集收敛目标不同，且具有从属关系，使用相对简单。本试验主要采用多层水平集框架模型。
图5显示了对多菌种、多特征菌落采用多层水平集框架模型的检测效果。其中图5-a是原图、图5-b是采用多层水平集框架模型的分割结果、图5-c对分割轮廓内部进行颜色填充以便观察。为解决部分菌落相互粘连的问题，试验中增加了分水岭粘连分割。
由图5不难看到，由于水平集活动轮廓模型分割技术是在极小化能量泛函的过程中，使活动轮廓不断逼近目标而实现对目标的分割，所以不存在对霉菌表面微小颗粒的过分割现象。此外，能量函数建立在轮廓内外的灰度方差基础上，因此活动轮廓在收缩时，不会受各种菌落颜色不同的影响而导致误分割。除极个别地方尚不完善外，绝大多数菌落都得到了准确的分割。
图5基于多层水平集框架模型的分割效果 4、展望
基于水平集活动轮廓模型的图像分割方法，具有抗噪性强、数值求解稳定性好、分割边界光滑连续、可以处理拓扑结构复杂的情况等优点，成为目前国际上最前沿的图像分割技术之一。多相CV模型和多层水平集框架模型都是基于水平集为基础，在解决多目标、多特征的分割问题上具有较好效果。为多菌种混杂情况的菌落检测提供了一种可行的方法。
但多相CV模型和多层水平集框架模型的每次迭代计算都需要初始化，导致计算量较大，分割耗时。随着问题复杂性的增加，其计算复杂性也显著升高。除此之外，这两种方法初始轮廓的选取还存在偶然性，预选区域的大小及形状均会影响分割的结果，须要进一步研究。
5、参考文献
[1] Zheng Gang, Li Yuanlu, Wang Huinan. A new multi-phase level set framework for 3D medical image segmentation based on TPBG [C]. 27th Annual International Conference of IEEE EMBC05, Shanghai, 2005.
[2] 王晓峰.水平集方法及其在图像分割中的应用研究[J].中国科学技术大学，2011(02).
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