| 葡萄球菌A蛋白（SPA）各种免疫检测试剂的制备
SPA试剂的种类很多，主要有SPA菌体，包括荧光菌体和各种抗体标记的菌体；SPA纯品标记的荧光素、同位素和酶标记试剂；用于亲和层析的SPA-Sepharose CL-4B、6MB和SPA—agarose，以及用于免疫电镜观察的SPA-铁蛋白、胶体金和SPA标记的血蓝蛋白等。下面分别介绍几种常用的SPA标记试剂的制备方法。
（一）SPA纯品的制备
目前市场上已有SPA纯品出售（美国Sigma、国内上海生物制品研究所均有SPA纯品出售），本书仅作了解性介绍。SPA纯品系由含A蛋白的Cowan I株金黄色葡萄球菌中纯化获得。其制备过程除细菌培养外，主要有提取和纯化这两个工艺组成。提取方法多种，其中溶葡萄球菌素与亲和色谱组合方法最有效。现介绍如下。
（1）用0．05mol／L（pH 7．5）的Tris—HCl洗下菌苔，每100g湿菌加溶葡萄球菌素5mg，调节pH值到3．5，离心后取上清，并将pH值调到7．0。
（2）用饱和硫酸铵沉淀，溶解透析，透析物用DEAE-SephadexA50纯化，以0．1mol／L碳酸氢铵（NH4HC03）平衡后上样，再平衡过夜。
（3）用0．4mol／LNH‘HCOa洗脱（流速1．5ml／min），样品测定AzTsam和活性，将含活性者合并、浓缩、冻干保存于一40~C中。
（4）上述纯化获得的SPA可进一步用IgG-Sepharose 4B亲和层析柱过滤，进一步纯化SPA。
（5）纯度鉴定 用7．5％聚丙烯酰胺凝胶为分离系统进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，样品浓度为lmg／m1，加样量为40／／l。电泳结果应显示一条明显条带。
（二）荧光A蛋白纯品的制备
荧光A蛋白纯品是在弱碱性条件下，由荧光素通过蛋白上的氨基共价包绕于A蛋白纯品制成。其制备如下。
（1）取一定量的A蛋白纯品，用内含0．05mol／L NaCl的0．1mol／L氧化钠溶液调节pH值到9．0。
（2）于23~C暗处条件下，按lmol的A蛋白中加入2．8mol的FITC，搅拌60min，随时用含0．15mol／L氯化钠的0．1mol／L氢氧化钠使pH值维持在9．0～9．5之间。
（3）然后将标记SPA用平衡盐溶液于4℃透析数次，过SephadexG-25柱，除去未标记的FITC，并调节浓度到lmg／ml，装入棕色瓶，并保存于一20~C冰箱中。
（三）酶标记A蛋白纯品的制备
HRP可以于共价键或非共价键方式黏附在其他的蛋白质分子上，常见的标记方法有戊二醛一步法和二步法，也可以用过碘酸钠氧化法，它们主要为共价键结合方式；另一种为非共价键结合方式，是用4，4’—二氟—3，3，—二硝基苯基砜（4，4／—difluoro-3，3，—initrophenyl sul—lone，FNPS）作为交联试剂。戊二醛二步法的标记效率要高于一步法，过碘酸钠氧化法的标记效率要高于戊二醛二步法。其主要原理是二种蛋白质分子的赖氨酸上的基团和含氨基的N端经活化剂活化而结合。由于抗体和酶分子上所具有的反应基团很少，需通过功能基团（如戊二醛）将更多的抗体和酶分子结合在一起，酶分子首先和双功能试剂结合，再与抗体分子结合，这样可以结合更多的酶和抗体，而且无聚合物产生。HRP还可以与生物素和亲和素结合。操作步骤如下。
（1）取HRP 5mg，溶于0．1ml新鲜配制的0．3mol／L（pH3．1） NaHC03中，加0．1ml1％二硝基氟苯—无水乙醇，于室温中避光轻轻搅拌1h。
（2）再加入0．08mol／LNalOa lml，室温中搅拌30min。
（3）再加0．08mol／L乙二醇lml，混匀后轻轻搅拌1h。
（4）装入透析袋中，在4℃条件下，用0．01mol／L（pH9．5）
（4）装入透析袋中，在4℃条件下，用0．01mol／L（pH9．5）碳酸盐缓冲溶液1500ml于2000ml烧杯中透析。
（5）称取纯晶SPA 5mg，加入上述经醛化的HRP中，在25℃下充分混匀，轻轻搅拌5h。
（6）加5mgNaBH4，置于4℃3h。
（7）结合物用0．02mol／L，（pH7．4）PBS4℃透析3～4次，加等量甘油，-40℃或冻干避光保存。
|
