| IHC(P) 免疫组化石蜡切片操作规程 ――(新手适用)
免疫组化操作规程――石蜡切片
(一)、仪器设备
1)18cm不锈钢高压锅或电炉或医用微波炉；
2)水浴锅
(二)、试剂
1)PBS缓冲液(pH7.2～7.4)：NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na2HPO4 4.3mmol/L， KH2PO4 1.4mmol/L。
2)0.01mol/L柠檬酸盐缓冲液(CB，pH6.0，1000ml)：柠檬酸三钠 3g，柠檬酸 0.4g。
3)0.5mol/L EDTA缓冲液(pH8.0)：700ml水中溶解186.1gEDTA·2H2O，用10 mmol/L NaOH调至pH8.0,加水至1000ml。
4)1mol/L的TBS缓冲液(pH8.0)：在800ml水中溶解121gTris碱，用1N的HCl调至pH8.0,加水至1000ml。
5)酶消化液： a、0.1%胰蛋白酶液：用0.1%CaCl2(pH7.8) 配制。 b、0.4%胃蛋白酶液：用0.1N的HCl配制。
6)3%甲醇-H2O2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配制。
7)封裱剂：
a、甘油和0.5mmol/L碳酸盐缓冲液(pH9.0～9.5)等量混合；
b、油和TBS(或PBS)配制。
8)TBS/PBS pH9.0～9.5，适用于荧光显微镜标本；pH7.0～7.4适合于光学显微镜标本。
(三)、操作流程
1、脱蜡和水化
脱蜡前，应将组织芯片在室温中放置60分钟或60℃恒温箱中烘烤20分钟。
1)组织芯片置于二甲苯中浸泡10分钟，更换二甲苯后再浸泡10分钟；
2)无水乙醇中浸泡5分钟；
3)95%乙醇中浸泡5分钟；
4)70%乙醇中浸泡5分钟；
2、抗原修复
用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片。
1)抗原热修复
(1)高压热修复 在沸水中加入EDTA(pH8.0)或0.01M枸橼酸钠缓冲溶液(pH6.0)。盖上不锈钢高压锅的盖子，但不进行锁定。将玻片置于金属染色架上，缓慢加压，使玻片在缓冲液中浸泡5分钟，然后将盖子锁定，小阀门将会升起来。10分钟后，去除热源，置入凉水中，当小阀门沉下去后打开盖子。本方法适用于较难检测或核抗原的抗原修复。
(2)煮沸热修复 电炉或者水浴锅加热0.01M枸橼酸钠缓冲溶液(pH6.0)至95℃左右，放入组织芯片加热10~15分钟。
(3)微波热修复 在微波炉里加热0.01M枸橼酸钠缓冲溶液(pH6.0)至沸腾后将组织芯片放入，断电，间隔5~10分钟，反复1-2次。适用的抗原有：AR，Bax，Bcl-2，C-fos，X-jun，C-kit，C-myc，E-cadherin，Chromogranin A，Cyclin，ER，Heat shock protein，HPV，Ki-67，MDMZ，p53，p34，p16，p15，P-glycoprotein，PKC，PR，PCNA，ras，Rb，TopoismeraseⅡ等。
2)酶消化方法 常用0.1%胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶液。胰蛋白酶使用前预热至37℃，切片也预热至37℃，消化时间约为5~30分钟；胃蛋白酶消化37℃时间为30分钟。适用于被固定遮避的抗原，其中有：Collagen，Complement，Cytokeratin，C-erB-2，GFAP，LCA，LN等。
抗原修复注意事项：
1)载玻片的处理：
抗原修复过程中，由于高温、高压、辐射等诸多因素的影响，极易造成脱片。为保证试验的正常进行，可选用PES、Poly-L-Lysine等试剂，对已清洗的载玻片进行处理。具体方法如下：
1.1 APES：现用现配。将洗净的玻片放入以1:50比例丙酮稀释的APES中，停留20~30秒钟，取出稍停片刻，再入纯丙酮溶液或蒸馏水中涮去未结合的APES，置通风橱中晾干即可。用此载玻片捞片时应注意组织要一步到位，并尽量减少气泡的存在，以免影响染色结果。
1.2 Poly-L-Lysine：将洗净、干燥的载玻片放入以1:10比例去离子水稀释的多聚赖氨酸溶液中，浸泡5分钟，60oC烤箱烘烤一小时或室温过夜干燥。装盒备用。试验中使用的器具均为非玻璃制品。
2)常用酶消化：
2.1 胰蛋白酶：一般使用浓度为0.05%~0.1%，消化时间为37℃、10~40分钟，主要用于细胞内抗原的显示。
2.2 胃蛋白酶：一般使用浓度为0.4%，消化时间为37℃、30~180分钟，主要用于细胞间质抗原的显示，如：Laminin(层粘蛋白)，Collagen IV(IV型胶原)等。
2.3 皂素(Saponin)：一般使用浓度为2~10?g/ml的saponin溶液，消化时间为室温孵育30分钟。
3)抗原热修复：
可根据实验室的具体条件，选用微波炉抗原修复、高压锅抗原修复或水浴高温抗原修复。抗原热修复可选用各种缓冲液，如TBS、PBS、重金属盐溶液等，但实验证明，以0.01M枸橼酸盐缓冲液(pH6.0)效果最好。请选用我公司提供的ZLI-9064 枸橼酸盐缓冲液(粉剂)配制，取该粉剂一包溶于1000ml的蒸馏水中，混匀，其pH值在6.0 ± 0.1，如因蒸馏水本身造成的pH值偏差，请自行调整。
3.1 石蜡切片微波炉抗原修复操作方法：切片脱蜡至水后，3％H2O2处理10分钟，蒸馏水洗2分钟×3。将切片放入盛有枸橼酸盐缓冲液(工作液)的容器中，置微波炉内加热使容器内液体温度保持在92℃~98℃之间并持续10~15分钟(注意：无论是使用医用或家用微波炉，请根据具体机型酌情设置条件，务必满足以上步骤中对温度和时间的要求)。取出容器，室温冷却10~20分钟(注意：不可将切片从缓冲液中取出冷却，以便使蛋白能够恢复原有的空间构型)。PBS洗，下接免疫组化染色步骤。
3.2 石蜡切片高压抗原修复操作方法：切片脱蜡至水。将1500ml~3000ml的枸橼酸盐缓冲液(工作液)注入不锈钢压力锅中加热至沸腾。切片置于金属架上，放入锅内，使切片位于液面以下，盖锅压阀。当压力锅开始慢慢喷气时(约加热5~6分钟后)，计时1~2分钟，然后将压力锅端离热源，冷水冲至室温后，取下气阀，打开锅盖，取出切片，蒸馏水洗后，PBS洗2分钟×3，下接免疫组化染色步骤。
3.3 石蜡切片电炉煮沸抗原修复操作方法：切片脱蜡至水后，放入盛有枸橼酸盐缓冲液(工作液)的容器中，并将此容器置于盛有一定数量自来水的大器皿中，电炉上加热煮沸，从小容器的温度到达92℃~98℃起开始计时15~20分钟，然后端离电炉，室温冷却20~30分钟，蒸馏水冲洗，PBS洗，下接免疫组化染色步骤。
3、免疫组织化学染色
SP法
1)脱蜡、水化；
2)PBS洗2～3次各5分钟；
3)3%H2O2(80%甲醇)滴加在TMA上，室温静置10分钟；
4)PBS洗2～3次各5分钟；
5)抗原修复；
6)PBS洗2～3次各5分钟；
7)滴加正常山羊血清封闭液,室温20分钟。甩去多余液体。
8)滴加Ⅰ抗50μl，室温静置1小时或者4℃过夜或者37℃1小时。
9)4℃过夜后需在37℃复温45分钟。
10)PBS洗3次各5分钟；
11)滴加Ⅱ抗40～50μl，室温静置，或37℃1小时；
12)II抗中可加入0.05%的tween-20。
13)PBS洗3次各5分钟；
14)DAB显色5～10分钟，在显微镜下掌握染色程度；
15)PBS或自来水冲洗10分钟；
16)苏木精复染2分钟，盐酸酒精分化；
17)自来水冲洗10～15分钟；
18)脱水、透明、封片、镜检。
SABC法
1)脱蜡、水化。
2)PBS洗两次各5分钟。
3)用蒸馏水或PBS配置新鲜的3%H2O2，室温封闭5～10分钟，蒸馏水洗3次。
4)抗原修复。
5)PBS洗5分钟。
6)滴加正常山羊血清封闭液，室温20分钟。甩去多余液体。
7)滴加Ⅰ抗,室温1小时或者4℃过夜或者37℃1小时(4℃过夜后在37℃复温45分钟)。
8)PBS洗三次每次2分钟。
9)滴加生物素化二抗,20℃～37℃20分钟。
10)PBC洗3次每次2分钟。
11)滴加试剂SABC，20℃～37℃20分钟。
12)PBS洗4次每次5分钟。
13)DAB显色：DAB显色试剂盒或者自配显色剂显色(镜下掌握显色程度)。
14)蒸馏水洗。苏木素复染2分钟、盐酸酒精分化。
15)脱水、透明、封片、镜检。
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