| 人Ⅱ型肺泡细胞表面抗原(KL-6)ELISA试剂盒说明书
本试剂盒仅供研究使用
产品编号：CSB-E12700h
检测范围：78 U/ml - 5000 U/ml
最低检测限：19.5 U/ml
特异性：本试剂盒可同时检测天然或重组的人KL-6，且与其他相关蛋白无交叉反应。
有效期：6个月
预期应用：ELISA法定量测定人血清、血浆、细胞培养上清或其它相关生物液体中KL-6含量。
说明
1．试剂盒保存：-20℃(较长时间不用时)；2-8℃(频繁使用时)。
2．浓洗涤液低温保存会有盐析出，稀释时可在水浴中加温助溶。
3．中、英文说明书可能会有不一致之处，请以英文说明书为准。
4．刚开启的酶联板孔中可能会含有少许水样物质，此为正常现象，不会对实验结果造成任何影响。
概述
Ⅱ型肺泡细胞表面抗原(KL-6, Krebs Von den Lungen-6)是Kohno等在1985年发现的，为一种肺腺癌相关抗原，它是一种大分子量糖蛋白。KL-6由MUC1基因编码，相对分子质量接近200000。在正常肺组织中，KL-6在II型肺泡细胞，呼吸性细支气管上皮细胞和支气管腺浆液细胞上表达。血清KL-6可反映肺泡损伤，II型肺泡细胞再生和多种间质性肺疾病的活动度。
实验原理
用纯化的抗体包被微孔板，制成固相载体，往包被抗KL-6抗体的微孔中依次加入标本或标准品、生物素化的抗KL-6抗体、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的KL-6呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值)，计算样品浓度。
试剂盒组成及试剂配制
1. 酶联板(Assay plate )：一块(96孔)。
2. 标准品(Standard)：2瓶(冻干品)。
3. 样品稀释液(Sample Diluent)：1×20ml/瓶。
4. 生物素标记抗体稀释液(Biotin-antibody Diluent)：1×10ml/瓶。
5. 辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液 (HRP-avidin Diluent)：1×10ml/瓶。
6. 生物素标记抗体(Biotin-antibody)：1×120μl/瓶(1：100)
7. 辣根过氧化物酶标记亲和素(HRP-avidin)：1×120μl/瓶(1：100)
8. 底物溶液(TMB Substrate)：1×10ml/瓶。
9. 浓洗涤液(Wash Buffer)：1×20ml/瓶，使用时每瓶用蒸馏水稀释25倍。
10. 终止液(Stop Solution)：1×10ml/瓶(2N H2SO4)。
需要而未提供的试剂和器材
1. 标准规格酶标仪
2. 高速离心机
3. 电热恒温培养箱
4. 干净的试管和Eppendof管
5. 系列可调节移液器及吸头，一次检测样品较多时，最好用多通道移液器
6. 蒸馏水，容量瓶等
标本的采集及保存
1. 血清：全血标本请于室温放置2小时或4℃过夜后于1000g离心20分钟，取上清即可检测，或将标本放于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。
2. 血浆：可用EDTA或肝素作为抗凝剂，标本采集后30分钟内于2 - 8°C 1000 g离心15分钟，或将标本放于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。
3. 细胞培养物上清或其它生物标本：1000g离心20分钟，取上清即可检测，或将标本放于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。
注：标本溶血会影响最后检测结果，因此溶血标本不宜进行此项检测。
标本的稀释原则：
首先通过文献检索的方式了解待测样本的大致含量，确定适当的稀释倍数。只有稀释至标准曲线的范围内，检测的结果才是准确的。稀释的过程中，应做好详细的记录。最后计算浓度时，稀释了“N”倍，标本的浓度应再乘以“N”。
标准品的稀释原则：2瓶，每瓶临用前以样品稀释液稀释至1ml，盖好后静置10分钟以上，然后反复颠倒/搓动以助溶解，其浓度为5000 U/ml，做系列倍比稀释后，分别稀释5000 U/ml，2500 U/ml，1250 U/ml，625 U/ml，312 U/ml，156 U/ml，78 U/ml，样品稀释液直接作为标准浓度0 U/ml，临用前15分钟内配制。
如配制2500 U/ml标准品：取0.5ml(不要少于0.5ml)5000 U/ml的上述标准品加入含0.5ml样品稀释液的Eppendorf管中，混匀即可，其余浓度以此类推。
生物素标记抗体的稀释原则：
临用前以生物素标记抗体稀释液稀释，稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量配制(每孔100μl)，实际配制时应多配制0.1-0.2ml。如10μl生物素标记抗体加990μl生物素标记抗体稀释液的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制。
辣根过氧化物酶标记亲和素的稀释原则：
临用前以辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液稀释，稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量配制(每孔100μl)，实际配制时应多配制0.1-0.2ml。如10μl辣根过氧化物酶标记亲和素加990μl辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液 的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制。
操作步骤
实验开始前，请提前配置好所有试剂，试剂或样品稀释时，均需混匀，混匀时尽量避免起泡。每次检测都应该做标准曲线。如样品浓度过高时，用样品稀释液进行稀释，以使样品符合试剂盒的检测范围。
1. 加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100μl，余孔分别加标准品或待测样品100μl，注意不要有气泡，加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，酶标板加上盖或覆膜，37℃反应120分钟。
为保证实验结果有效性，每次实验请使用新的标准品溶液。
2. 弃去液体，甩干，不用洗涤。每孔加生物素标记抗体工作液 100μl(取1μl生物素标记抗体加99μl生物素标记抗体稀释液的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制)，37℃,60分钟。
3. 温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分钟，200μl/每孔，甩干。
4. 每孔加辣根过氧化物酶标记亲和素工作液(同生物素标记抗体工作液) 100μl，37℃，60分钟。
5. 温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分钟，200μl/每孔，甩干。
6. 依序每孔加底物溶液90μl，37℃避光显色(30分钟内，此时肉眼可见标准品的前3-4孔有明显的梯度蓝色，后3-4孔显色不明显，即可终止)。
7. 依序每孔加终止溶液50μl，终止反应(此时蓝色立转黄色)。终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同。为了保证实验结果的准确性，底物反应时间到后应尽快加入终止液。
8. 用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度(OD值)。 在加终止液后15分钟以内进行检测。
注：
1. 用户在初次使用试剂盒时，应将各种试剂管离心数分钟，以便试剂集中到管底。
2. 每次实验留一孔作为空白调零孔，该孔不加任何试剂，只是最后加底物溶液及2N H2SO4。测量时先用此孔调OD值至零。
3. 为防止样品蒸发，试验时将反应板放于铺有湿布的密闭盒内，酶标板加上盖或覆膜。
4. 未使用完的酶标板或者试剂，请于2-8℃保存。标准品、生物素标记抗体工作液、辣根过氧化物酶标记亲和素工作液请依据所需的量配置使用。请勿重复使用已稀释过的标准品、生物素标记抗体工作液、或辣根过氧化物酶标记亲和素工作液。
5. 建议检测样品时均设双孔测定，以保证检测结果的准确性。
洗板方法
手工洗板方法：吸去(不可触及板壁)或甩掉酶标板内的液体；在实验台上铺垫几层吸水纸，酶标板朝下用力拍几次；将推荐的洗涤缓冲液至少0.3ml注入孔内，浸泡1-2分钟。根据需要，重复此过程数次。
自动洗板：如果有自动洗板机，应在熟练使用后再用到正式实验过程中。
计算
以标准物的浓度为横坐标(对数坐标)，OD值为纵坐标(普通坐标)，在半对数坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。
注意事项
1. 当混合蛋白溶液时应尽量轻缓，避免起泡。
2. 洗涤过程非常重要，不充分的洗涤易造成假阳性。
3. 一次加样时间最好控制在5分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。
4. 请每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔。
5. 如标本中待测物质含量过高，请先稀释后再测定，计算时请最后乘以稀释倍数。
6. 在配制标准品、检测溶液工作液时，请以相应的稀释液配制，不能混淆。
7. 底物请避光保存。
8. 不要用其它生产厂家的试剂替换试剂盒中的试剂。
|
